威尼德分子杂交仪：核酸分子杂交中造成高背景的影响因数

1杂交溶液或洗涤溶液在使用前未预热

2探针浓度过高或探针未变性。将杂交液装入杂交管时，体积减少，探针浓度发生了变化，应确保相应地调整探针浓度。

3未从探针溶液中去除未结合核苷酸。

4预杂交和杂交溶液中的预杂交或阻断剂不足，充分的预杂交对于阻止膜的非特异性杂交非常重要。

5杂交或洗脱条件不够严格：

6降低盐浓度。

7提高温度。

8增加SDS的浓度。

9增加洗脱次数。

10膜太干燥，这通常可能是明显重叠问题的原因，可能由以下原因引起：

11探针体积太小。溶液更换速度太慢，尤其是批量更换处理时分子杂交仪放置不平整。

可变轴角度过大。

12膜上残留的琼脂糖可能导致背景模糊。在转化膜后和固定交联前（尤其是真空吸干后），应在2 x SSC中冲洗膜，以去除残留的琼脂糖和多余的盐。

13多个过滤器在瓶子中没有用筛网隔开。

14放射自显影问题。放射自显影图上的随机黑点和“闪电”标记可能是由静电引起的。